Weg mit dem Alten, her mit dem Neuen: Larry Daley (Ben Stiller) hat keine Lust mehr auf seinen Nachtwächterjob im New Yorker Naturkundemuseum und versucht stattdessen, als Erfinder mit einer eigenen TV-Verkaufsshow groß rauszukommen. Bald muss er jedoch feststellen, dass er die Nächte im Museum vermisst - Nächte, in denen die Ausstellungsstücke zum Leben erwachen! Doch nun soll ein Großteil der Exponate in die unterirdischen Kellerarchive des Smithsonians, dem in Washington gelegenen größten

Maya reist zusammen mit ihrem Hund Lucky nach Hollywood, wo ihre Begabung, mit Tieren sprechen zu können, ihr schnell eine eigene Talkshow bekommt. Dies zieht so einige Konsequenzen nach sich, unter anderem verliebt sich Lucky in eine Hundedame, die einen angesehenen Stammbaum vorweisen kann. Und Maya träumt noch immer davon, Tierärztin zu werden – vielleicht können Lucky, seine neue Freundin und andere Tiere ihr bei der Verwirklichung ihres Traums helfen.